COLORIMETRIA

La colorimetría es una de las técnicas empleadas en los laboratorios de Bioquímica. Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente.

La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está relacionada con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos relaciones están combinadas en la ley de Lambert-Beer:

log Io/I=?c1

En donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l el paso óptico de la muestra absorbente (cm), c la concentración de la especie absorbente (moles/litro) y ∈ el coeficiente de absorción molar. La expresión log Io / I se denomina absorbancia y se designa por A (siendo adimensional). Fijando el paso óptico (habitualmente 1 cm), resulta que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentración del soluto absorbente. El coeficiente de absorción molar varía con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda y también con el pH.

La aplicación de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (Carotenos, clorofila, hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados coloreados.

Los espectros de absorción, gráficos que relacionan absorbancia con longitudes de onda, son frecuentemente utilizados en Bioquímica para la caracterización e identificación de biomoléculas.

Uso del colorímetro:

1. Encender el instrumento y esperar unos 10 minutos antes de proceder a la realización de medidas. A continuación seleccionar el modo Absorbancia.
2. Seleccionar la longitud de onda deseada. Ajustar el cero de absorbancia, usando para ello la cubeta del colorímetro con el disolvente de la muestra (el blanco) y presionando el botón de calibración.
3. A continuación se mide la absorbancia de la muestra utilizando la misma cubeta del colorímetro pero previamente bien lavada.
4. Para leer a otras longitudes de onda realizar los ajustes descritos en 2.