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QUÉ ES BIOLOGIA MOLECULAR
En microbiología permiten la detección de porciones de ácidos nucleicos (AN) (DNA o RNA) que son específicos de cada microorganismo, en diferentes materiales clínicos. Su aplicación, surge como una necesidad para poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollos tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad diagnóstica. Esta circunstancia se ajusta principalmente a la detección de virus, es por ello, que el desarrollo de técnicas moleculares
comenzó en esta área.
Las primeras técnicas de BM, utilizadas desde los años 70 se basan en el mismo principio que las actuales, que es la hibridación (unión de pares de bases complementarias) entre cadenas deAN. Esta unión es de alta especificidad, superior a la unión Ag-Ac, pero carecen de sensibilidad, lo que las convirtió en poco útiles para la detección y se utilizan principalmente para la identificación de microorganismos.
En la década de los 80, la incorporación de la amplificación de AN a través de enzimas termoestables (polimerasas) y la evolución de los sistemas de detección, permitió mejorar notablemente la sensibilidad. Todo este proceso que comenzó en los laboratorios de investigación se hatrasladado a nuestro laboratorio,formando parte de una de las herramientas más importantes para colaborar en el diagnóstico de alta complejidad en la práctica diaria. Ejemplo: informes de carga viral de Citomegalovirus, en 24 hs, en urgencias clínicas de pacientes transplantados.
¿Cómo evolucionaron las técnicas moleculares?
En la evolución de las técnicas moleculares, se fueron incorporando mejoras en función de minimizar las principales desventajas.El primer punto es haber trasladado muchas de las metodologías caseras a formatos comerciales, permitiendo una mejor estandarización, evaluación de controles internos y externos internacionales, e interpretación adecuada de los resultados para evaluar el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de los pacientes.
En forma conjunta, se dio la incorporación de los controles internos que pueden ser de concentración conocida,que consisten en transcriptos similares al target a medir pero con una diferencia de 25 a 30 pb, que se amplifiquen con los mismos cebadores (primers) y acompañan todos los pasos de la muestra, pero pueda detectarse en forma separada.
Esto generó la capacidad de controlar el aislamiento, la amplificación, la detección, la presencia de inhibidores y realizar la cuantificación en cada muestra en particular, ya que la utilización de una curva externa con calibradores, no era de utilidad por la gran variabilidad que producen los diferentes pasos de las técnicas moleculares.Sin ninguna duda, este fue un paso sustancial que
permitió cuantificar el AN detectado (carga viral), metodología que fue incorporada rápidamente al seguimiento de pacientes con infecciones virales crónicas, así como también a una mejor evaluación de los resultados obtenidos con las técnicas cualitativas que definen patologías de extrema importancia,como por ejemplo: Sistema Nervioso Central (SNC).
El segundo punto importante, era el efecto negativo y de d ifí c i l c o nt r o l c om o s o n l a s c o nt am i n a c i o n e s,fundamentalmente aquellas producidas por reamplificación del producto de amplificación previo o “Amplicones”. Para ello, se utilizan métodos químicos y físicos que intentan eliminar en su totalidad la presencia de amplicones, sin embargo, ninguno es totalmente efectivo y es fundamental un correcto esquema de trabajo y estructura adecuada.
La incorporación de la automatización en los diferentes pasos, como el aislamiento, amplificación y la detección,permitieron generar esquemas de trabajo cerrados donde, al no abrirse tubos con productos de amplificación, la diseminación de “amplicones” es insignificante y por consiguiente el fantasma de la contaminación que venía acompañando a las técnicas moleculares, en particular a las Nested PCR (Doble round de PCR) como lo son la mayoría de las técnicas caseras para aumentar la sensibilidad, se convierte en anecdótico.
El tercer inconveniente que comenzó a surgir a través del tiempo, es poder realizar cuantificaciones de microorganismos, donde la cantidad de muestras en los laboratorios nunca serán suficientes como para que las empresas de diagnóstico generen equipos comerciales controlados y estandarizados, así como la necesidad de resultados en tiempos más cortos y siempre generando
resultados cada vez más exactos, fue dando origen a las técnicas moleculares en tiempo real.
¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las técnicas de Biología Molecular?
Ventajas:
- Su capacidad de multiplicación de la porción de AN buscada en el orden de 106-9 copias y la detección a través de técnicas de ELISA, Hibridación, etc., le confieren su altísima sensibilidad.
- La utilización de iniciadores que reconocen una secuencia única elegida propia de cada microorganismo, le confiere su altísima especificidad.
- Su rapidez comparada con algunas técnicas tradicionales.
- La característica de detectar “presencia de AN” en vez de “viabilidad de microorganismos” permite su realización en una gran variedad de muestras.
- La capacidad de determinar la cantidad de AN específico (Cuantificación o Carga Viral), a través de la incorporación de controles internos de concentración conocida.
Desventajas:
- La falta de estandarización de las técnicas “HOME MADE”.
- La probabilidad de resultados falsos positivos por contaminación con productos de amplificados anteriores “Amplicones”, hace necesario una cuidadosa evaluación de sus resultados.
- La probabilidad de falsos negativos por la presencia de inhibidores o inconvenientes en los diferentes pasos de las técnicas, esto se controla y detecta con la incorporación de controles internos.
- No permite el aislamiento del microorganismo para la posterior detección de resistencia.
- Los costos. Si sólo se las compara con las técnicas tradicionales y no se las evalúa en el contexto total del cuidado del paciente y gastos indirectos de las entidades de salud.
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