"TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS?

INTRODUCCIÓN

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.
La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.
 

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Unclon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
 

Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
o La contaminación y pérdida del cultivo en estudio o La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.

En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.
 

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.
Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.